细胞培养基中的添加剂及其作用,细胞培养基中有芽孢杆菌,能用0.22um的滤膜除去吗?
1、细胞培养基中的添加剂及其作用
培养某1类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养;RPMI-1640做悬浮细胞和人白血病细胞单层培养是1个好的开始，它也广泛应用于哺乳动物细胞和杂交瘤细胞的培养，如人骨髓瘤细胞、鼠杂交瘤细胞、人白细胞以及B细胞和T细胞;各种目的无血清培养最好首选AIM V(12005)培养基(SFM)。选择细胞的培养基也可以到ATCC上查询，ATCC (American Type Culture Collection) 收集了绝大多数细胞的详细资料。打开ATCC网页的Cells and hybridomas链接，输入细胞名称就可以搜索ATCC的细胞数据库。数据库中有每1种细胞的详细描述，包括细胞的来源，培养和冻存条件，以及相关文献等资料。 同1种培养基也会因其添加物的不同而应用于不同的细胞培养和不同的实验需求，下面就详细介绍下培养基中各种添加剂的功能。1. L-谷氨酰胺(L-Glutamine)在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?是细胞生长的必须氨基酸，为培养的细胞提供重要的能量来源。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过1段时间后会降解，降解率随保存温度而变。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于1些细胞具有毒性。2. GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个2肽有多稳定?GlutaMAX-I 即谷丙氨酸2肽，是1个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。1种肽酶逐渐裂解2肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I2肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 2肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。3. 培养基中丙酮酸钠的作用是什么?丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。4. Hank′s 平衡盐溶液(HBS)和Earle′s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagle′s (2.2g/L)中比在Hanks′ (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagle′s液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks′液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagle′s液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks′液就可以了。5. 培养液pH对细胞生长的影响?由于大多数细胞适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞1般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强1些。在配制培养用液时，需要注意1点：培新配的培养基在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。6. 培养细胞时应使用5%还是10%CO2，或者根本没有影响?答：1般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10% CO2;当培养基中NaHCO3为每公升1.5g 时，则应使用5%CO2培养细胞。7. Hepes的作用HEPES溶液：是1种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了 5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。1般在进行克隆化培养时要添加HEPES。神经细胞原代培养的过程中能用到8. NaHCO3培养基中使用了NaHCO3-CO2缓冲系统，并采用开放培养，使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中CO2浓度(5%)，与培养基中的NaHCO3处于平衡状态，从而调节培养基的PH值。9. NEAA：非必须氨基酸NEAA(非必需氨基酸)是含几种非必需氨基酸的合剂，添加到的原培养基不同，NEAA也有不同的种类，比如添加至MEM的NEAA，含L-Alanine、L-Asparagine、 L-Aspartic Acid、L-Glutamic Acid、L-Glycine、L-Proline、L-Serine。10. 氯化钙氯化钙对成骨细胞培养有毒性，所以成骨细胞的培养基中应不含氯化钙。11. 什么培养基中可以省去加酚红?酚红在培养基中用作pH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。酚红本身对生物制品质量并不会产生影响，可以通过纯化技术去除，但酚红在无血清培养基可能带来胞内钠/钾失衡，影响细胞生长，当然这种作用能被血清所中和或减轻。酚红并不是培养基中必需的1种成分，很多国外的疫苗或抗体生产企业在生产过程中都使用无酚红培养基。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，(特别是雌激素)。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，1些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 你可以到生物帮那里详细的了解1下，那里有介绍的，如果有问题，那里还有在线交流核心版块，可以帮助你找到答案，看看 www.bio1000.com/zt/cell/45828.html 会有帮助的。
2、细胞培养基中有芽孢杆菌,能用0.22um的滤膜除去吗?
0.22不好说，0.1应该没有问题。
3、请问细胞培养液怎么弄？
) 配制培养基最好使用新制备的3蒸水。1般在试验前当天或前1天制备为好。调节pH值的酸碱溶液也应该使用这种水配制。
2) 制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用（滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都应进行灭菌）。
3) 溶解培养基：将干粉培养基溶于总量1/3的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中。振荡或超声助溶，1般不要加热助溶。
4) 补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。
5) 加抗生素：1般抗生素终浓度为――青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。市售青霉素为80万U／瓶，可溶于4ml体积，每1升培养液中加0.5ml即可。市售链霉素为100万U／瓶，可溶于5ml体积，每1升培养液中也加0.5ml即可。无链霉素的情况下，用庆大霉素代替，终浓度调为50～200U/ml。
6) 调pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情况下），然后用5％ NaHCO3调节pH到7.2。
7) 过滤除菌：宜采用0.45um和0.22um滤膜各1张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果。注意滤膜正面（光面）朝上。过滤后分装于小瓶中（100或200ml）。
8) 加小牛血清：根据培养基配制的量将小牛血清分装，冷冻保存（－20℃）。临用前将加入小牛血清(10%~20%)。
【注意事项】
每次配液时，需要的其他辅助性液体（Hanks，胰蛋白酶消化液，PBS，抗生素溶液等）也可以同时配制，分别过滤。
市售小牛血清使用前多应该灭活（56℃，30min），以消除补体活性。动物血清个体差异大，故而每1批血清都进行严格检测，同时进行无菌试验。优质血清应该为淡黄色，透明，无溶血，无沉淀，灭活后颜色稍深。生化检测总蛋白含量3.5~4.5g/100ml，球蛋白不高于2g／100ml。选定1个效果较好的批号后，可1次多购该批号的血清，保证试验条件的稳定。
由于市售小牛血清pH未知，但大多偏酸。试验中加入小牛血清后，培养基的pH可能还会变化，故亦可先加入小牛血清后调pH值。但此种方法过滤较困难，只适于正压过滤。
培养液配好后，应先抽取少许放入培养瓶内，于37℃温箱内置24～48hr，以检测培养液是否有污染。
每次配液量以两周左右为宜，1次配液不要太多，防止营养成分（主要为谷氨酰胺）损失，造成实验繁琐或者污染。
4、干细胞培养液的灭菌方法是什么
培养液配制前，先将配置培养基所用的水和瓶子高温高压灭菌，我们这里是配置用灭菌水配置DMEM，调好pH值，在用0.22um滤膜过滤，在加如FBS，细胞因子等东西。最终用的干细胞培养基是不能高温高压灭菌的。
5、什么是细胞培养用液 , 主要分为哪几类 ? 2.D-Hank ’ s 与 Hank ’ s 的主要区别是什么 ? 3.简...
1.什么是细胞培养用液 , 主要分为哪几类 ? (1) 培养用液 是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。 (2) 主要包括: 平衡盐溶液 ; 培养基; 其他培养用液 。 2.D-Hank ’ s 与 Hank ’ s 的主要区别是什么 ? D-Hank ’ s 不含有 Ca2+ 、 Mg2+ ,常用于配制胰酶溶液。 3.简述胰酶的常用浓度及配制时的注意事项? 胰酶 (trypsin) 溶液: 浓度1般为 0.1 %~ 0.25 % , 配制时要用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 及血清的平衡盐溶液 。 4.血清的使用与储存有哪些注意事项? ( 1 ) 使用前的处理:使用前通常在 56 °C加热 30 分钟,这1过程称为灭活 。 热灭活目的:灭活血清中的补体成分。对于1些品质高的胎牛血清和新生牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。 ( 2 ) 储存条件:血清1般储存于- 20 °C , 同时应避免反复冻融 。 大包装的血清,首先将血清灭活处理,然后分装为小包装,如 10ml 、 20ml 、 50ml ,储存于 -20 °C,使用前融化。融化后的血清在 4 °C不宜长时间存放,应尽快使用。 5.简述干粉培养基的配制过程? DMEM 培养液的配制(举例): (1) 900 mL ddH2O 于 1000 mL 烧杯中,将 DMEM 粉 1 包倒入其中,盛粉袋用 50 mL ddH2O 分次冲洗,也倒入容器,磁力(或玻棒)搅拌溶解。 (2) 用 5 %- 10 %的 NaHCO3 调 pH 至 7.2 。 (3) 加青、链霉素至终浓度 100u/mL 和 100ug/mL (4) 用 0.22um 的滤膜过滤除菌。 (5) 分装( 200 mL 左右)后 4 °C冰箱保存。 11.何谓传代培养?简述贴壁细胞的传代操作步骤? (1) 传代培养 是指细胞从1个培养瓶以 1 : 2 或其他比率转移,接种到另1培养瓶的培养。 (2) 贴壁细胞传代培养: 1 选取生长良好的细胞,在超净工作台的酒精灯旁,倒去瓶中的旧培养液,加入 2 ~ 3ml 的 D- Hanks 液,轻轻振荡漂洗细胞,以除去悬浮在细胞表面的碎片 。 2 加入适量 0. 1%- 0.25 %胰蛋白酶消化液,室温消化,倒置显微镜下观察,待细胞单层收缩突起出现空隙时,倒去酶液。 3 用 Hanks 液洗涤 1 次,加入适量培养液,反复吹打细胞,使其成细胞悬液。 4 以 1 : 2 或 1 : 3 进行分装,并在培养瓶上做好标记,注明代号、日期,轻轻摇匀, 37 °C CO2 培养箱培养。 5 观察:细胞培养 24h 后,即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。 6.收集细胞时1般常用的转速和时间是多少? 转速: 1 000r/min ; 时间: 5min 7. 细胞计数的操作要领及计算公式是什么? (1) 具体操作程序如下: 1 取血细胞计数板和盖玻片,用 75% 酒精擦净。将盖玻片放于计数板上。 2 用滴管取混合均匀的细胞悬液,滴入计数室内。要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。滴加细胞悬液后约静置 1 分钟后则可以进行计数。 3 统计4个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,分别数出4角的4个大格(每个大格含有 16 个中格)中的细胞数。对压边线细胞:计上不计下,计左不计右 (2) 计算:1般以每毫升含细胞数来表示 , 大方格的面积为 1mm 2 ,室深为 0.1mm ,则体积为 0.1mm 3 。推算得 0.1mm 3 × 10 4 ,才为 1ml 体积。所以计算公式为:细胞悬液的细胞数) /ml =( 4个大格子细胞数 /4) × 10 4 ×稀释倍数 ; 计数中,如果细胞悬液的细胞浓度过高,必须稀释后再计;如果细胞数太少 , 可离心浓缩后再计。每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。 (3) 用细胞计数板计数时应注意的事项 : 1 不要漏计,不要重复 2 细胞悬液应混合均匀 3 浓度不可过高也不可过低。 8.简 述细胞生长曲线绘制过程及其应用? (1) 细胞生长曲线 (cell growth curve) 是观测细胞在1代生存期内的增生过程的重要指标,可根据细胞生长曲线分析细胞增殖速度,确定细胞传代、细胞冻存或具体实验的最佳时间。它以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。 (2) 制作方法: 1 培养细胞 : 首先在 2 4孔培养板内分别接种相同数量的细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。 2 计数细胞密度 : 从接种时间算起,每隔 24h 计数3孔内的细胞密度,算出平均值。为提高准确率,对每孔细胞可计数 2 ~ 3 次。如此操作至第7天结束。 3 绘制曲线 : 以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标,将全部结果在坐标纸上绘图,即得所培养细胞的生长曲线。
6、细胞培养基中的添加剂及其作用
培养某类型细胞没有固定培养条件MEM培养细胞能DMEM或M199同样容易生长总之首选MEM做粘附细胞培养;RPMI-1640做悬浮细胞和人白血病细胞单层培养好开始也广泛应用于哺乳动物细胞和杂交瘤细胞培养人骨髓瘤细胞、鼠杂交瘤细胞、人白细胞及B细胞和T细胞;各种目无血清培养好首选AIM V(12005)培养基(SFM)选择细胞培养基也ATCC上查询ATCC (American Type Culture Collection) 收集了绝大多数细胞详细资料打开ATCC网页Cells and hybridomas链接输入细胞名称搜索ATCC细胞数据库数据库有每种细胞详细描述包括细胞来源培养和冻存条件及相关文献等资料 同种培养基也会因其添加物同而应用于同细胞培养和同实验需求下面详细介绍下培养基各种添加剂功能1. L-谷氨酰胺(L-Glutamine)细胞培养重要?溶液稳定?细胞生长必须氨基酸培养细胞提供重要能量来源脱掉氨基L-谷氨酰胺作培养细胞能量来源、参与蛋白质合成和核酸代谢L-谷氨酰胺溶液经过段时间会降解降解率随保存温度而变L-谷氨酰胺降解导致氨形成而氨对于些细胞具有毒性2. GlutaMAX-I?培养细胞何利用GlutaMAX-I?2肽有多稳定?GlutaMAX-I 即谷丙氨酸2肽L-谷氨酰胺衍生物其稳定alpha-氨基用L-丙氨酸来保护种肽酶逐渐裂解2肽释放L-谷氨酰胺供利用GlutaMAX-I2肽非常稳定即使121磅灭菌20分钟GlutaMAX-I 2肽溶液有小降解相同条件下L-谷氨酰胺几乎完全降解3. 培养基丙酮酸钠作用?丙酮酸钠作细胞培养替代碳源尽管细胞更倾向于葡萄糖作碳源没有葡萄糖细胞也代谢丙酮酸钠4. Hank′s 平衡盐溶液(HBS)和Earle′s平衡盐溶液(EBS)有本质功能差别?HBS和 EBS 主要差别于碳酸氢钠水平,Eagle′s (2.2g/L)比Hanks′ (0.35g/L) 高碳酸氢钠需用高水平CO2平衡维持溶液PH值Eagle′s液空气水平CO2 溶液会变碱Hanks′液CO2培养箱会变酸希望CO2培养箱保存组织需要用Eagle′s液仅仅清洗要细胞培养基储存组织用Hanks′液了5. 培养液pH对细胞生长影响?由于大多数细胞适宜pH7.2-7.4偏离此范围能对细胞生长产生有害影响各种细胞对pH要求也完全相同原代培养细胞般对pH变动耐受差无限细胞系耐受力强总体来说细胞耐酸性比耐碱性强些配制培养用液时需要注意点:培新配培养基经过0.10um或0.22um滤膜过滤时溶液pH还会向上浮动0.2左右6. 培养细胞时应使用5%还10%CO2或者根本没有影响?答:般培养基大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作pH 缓冲系统而培养基NaHCO3含量决定细胞培养时应使用CO2浓度当培养基NaHCO3 含量每公升3.7g时细胞培养时应使用10% CO2;当培养基NaHCO3每公升1.5g 时则应使用5%CO2培养细胞7. Hepes作用HEPES溶液:种弱酸文名字羟乙基哌秦乙硫磺酸主要作用防止培养基pH迅速变动开放式培养条件下观察细胞时培养基脱离了 5%CO2环境CO2气体迅速逸出pH迅速升高若加了HEPES此时维持pH7.0左右般进行克隆化培养时要添加HEPES神经细胞原代培养过程能用8. NaHCO3培养基使用了NaHCO3-CO2缓冲系统并采用开放培养使细胞代谢产生CO2及时溢出培养瓶再通过稳定调节温箱CO2浓度(5%)与培养基NaHCO3处于平衡状态从而调节培养基PH值9. NEAA:非必须氨基酸NEAA(非必需氨基酸)含几种非必需氨基酸合剂添加原培养基同NEAA也有同种类比添加至MEMNEAA含L-Alanine、L-Asparagine、 L-Aspartic Acid、L-Glutamic Acid、L-Glycine、L-Proline、L-Serine10. 氯化钙氯化钙对成骨细胞培养有毒性所成骨细胞培养基应含氯化钙11. 培养基省去加酚红?酚红培养基用作pH值指示剂:性时红色酸性时黄色碱性时紫色酚红本身对生物制品质量并会产生影响通过纯化技术去除酚红无血清培养基能带来胞内钠/钾失衡影响细胞生长当种作用能被血清所和或减轻酚红并培养基必需种成分多国外疫苗或抗体生产企业生产过程都使用无酚红培养基研究表明酚红模拟固醇类激素作用(特别雌激素)避免固醇类反应培养细胞尤其哺乳类细胞时用加酚红培养基由于酚红干扰检测些研究人员做流式细胞检测时使用加有酚红培养基 生物帮里详细了解下里有介绍有问题里还有线交流核心版块帮助找答案看看 www.bio1000.com/zt/cell/45828.html 会有帮助。
